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副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，广泛分布于海洋环境和海洋生物中。人们通常因吃了生的或加热不良的海产品而引起的副溶血性弧菌中毒。自1996年以来，致病性副溶血菌性弧菌主要集中在几个血清型（如O3:K6、O4:K68和O1:KUT）中，其中O3:K6流行群是副溶血性弧菌最主要的流行群，显示某些特定血清型可能与人类疾病更相关。这一流行群可能是通过抗原基因簇及其相邻序列的重组从同一祖先进化而来。

LPS在大多数革兰氏阴性病原体的致病机制中起着重要作用。典型的LPS由三部分组成：O-特异性多糖侧链、脂质A和核心低聚糖。副溶血性弧菌缺乏O-特异性多糖侧链，其O抗原表型由核心低聚糖决定，核心低聚糖是LPS的重要组成部分。O抗原合成基因通常以簇的形式出现，称为O抗原基因簇。waa或rfa基因家族负责核心低聚糖的合成。waaf是编码庚基转移酶II的基因，庚基转移酶II是合成核心低聚糖的重要酶，其功能的丧失导致核心低聚糖结构的改变，而这可能导致革兰氏阴性细菌O抗原结构的改变。目前，有关waaf基因对副溶血性弧菌血清以及致病特性的作用尚不确切。

重庆三峡学院生物与食品工程学院赵峰博士、中国水产科学研究院黄海水产研究所周德庆研究员等在本文中通过基因敲除手段构建了O3:K6血清型副溶血性弧菌的waaf基因缺失突变体（Δwaaf），通过研究分析显示Δwaaf菌株的O抗原特性消失，致病能力也同时下降。深入分析结果显示O抗原同副溶血性弧菌的黏附和侵袭作用密切相关。

图1 图文摘要

利用甲壳素介导的转化技术构建O3:K6菌株（WT）的waaf基因缺失突变体（Δwaaf），并采用结合转移的方法构建了回补菌株（C-Δwaaf）。将三种菌株接种于MLB培养基上，结果显示三种菌株的生长曲线基本一致，表明基因缺失并未影响菌体的正常生长。血清分型结果显示，Δwaaf菌株的血清特性消失，无法与O3和K6抗血清反应，而C-Δwaaf菌株的血清特性得到了恢复，上述结果表明waaf基因可控制副溶血性弧菌的血清特性。

图2 WT、Δwaaf和C-Δwaaf生长曲线与血清分型结果

扫描电镜观察结果显示，Δwaaf菌株的胞外物质明显减少，菌体表面更光滑，鞭毛缺失。WT和C-Δwaaf表现出相似的状态，胞外物质较多，细胞聚集在一起，鞭毛完整。上述结果表明，waaf基因可影响副溶血性弧菌胞外物质，主要是多糖的产生，waaf基因敲除还可造成鞭毛缺失。

图3 WT（A）、Δwaaf（B）和C-Δwaaf（C）的扫描电镜结果

将三种菌株分别灌胃小鼠，观察小鼠的生长和存活情况。结果显示，三种菌株均会造成小鼠死亡，但小鼠的存活率存在显著差异，灌胃Δwaaf菌株的小鼠存活率显著高于其他两种菌株，表明waaf基因对副溶血性弧菌致病能力有影响，waaf基因敲除后，副溶血性弧菌的致病性显著降低。小鼠的肠道和肝脏切片也显示了相同的结果。

图4 WT、Δwaaf和C-Δwaaf菌株灌胃小鼠结果

利用Caco-2细胞测定了三种菌株的侵袭能力，结果显示，Δwaaf菌株的侵袭了显著低于另外两种菌株；灌胃小鼠的肠道中副溶血性弧菌的计数结果显示，灌胃Δwaaf菌株的小鼠肠道中的副溶血性弧菌数量明显少于其他两种菌株，上述结果表明waaf基因敲除可造成菌体黏附力降低。

图5 WT、Δwaaf和C-Δwaaf菌株黏附力测定

采用荧光定量PCR分别测定了三种菌种中的副溶血性弧菌主要毒力基因（tdh）及其waaf上下游基因表达量的变化，结果显示tdh在三种菌株的含量基本一致，而waaf基因下游基因VP0211的表达量显著降低。结果显示，waaf不影响tdh的表达，但其在O抗原合成中具有关键作用，其缺失可影响O抗原基因的表达。

图6 tdh和waaf上下游基因表达量变化图

waaf基因可以控制副溶血性弧菌的血清型变化。waaf基因的缺失可影响细胞外膜多糖的变化，导致副溶血性弧菌的O和K血清型的消失，进而降低细菌的侵袭力，削弱副溶血性弧菌的毒性。