浙江大学沈立荣教授:王浆主蛋白的超高效液相色谱串联三重四级杆质谱定量方法及在蜂蜜真实性检测中的应用_杏鑫代理中心

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责任编辑:食品科学

原标题:浙江大学沈立荣教授:王浆主蛋白的超高效液相色谱串联三重四级杆质谱定量方法及在蜂蜜真实性检测中的应用

亮点

研发了蜂蜜质量控制的超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC-TQMS)检测方法

采用(UPLC-TQMS)方法对定量检测了蜂蜜中的王浆主蛋白(MRJPs)

筛选出了MRJPs的定量检测特异性多肽标志物

构建了70种真实性蜂蜜样品的MRJP 1~3含量阈值数据库

展示了真实性蜂蜜分析的内源性标志物MRJP 1~3的应用前景。

Introduction

掺假掺杂是国际蜂蜜行业长期存在的问题,对蜂蜜产业的健康发展造成了极其严重的影响。现有蜂蜜掺假检测方法虽然可以有效、针对性地控制已知的掺假现象,但是缺乏对新型掺假的预警和快速反应能力,存在检测技术开发落后于掺假技术和掺假监管成本过高等缺点,导致难以彻底杜绝蜂蜜掺假现象的发生。近年来,基于蛋白组学和代谢组学的生物标志物检测技术在食品真实性检测领域的受到广泛的应用,为以蜂蜜的内源性蛋白-王浆主蛋白(Major royal jelly proteins, MRJPs)作为蜂蜜的真实性检测标志物的研究奠定了基础。但由于蜂蜜中的主蛋白含量较低,国内外迄今尚缺乏精准定量的检测可靠方法。

近年来,浙江大学食品科学与营养系沈立荣教授团队联合张进杰研究员领导的秦皇岛海关技术中心国家蜂蜜重点实验室、浙江粮油质量检测中心、杭州蜂之语蜂业股份有限公司,开展了以蜂蜜中的MRJPs为特征性标志物,利用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC-TQMS)检测技术建立了蜂蜜中主蛋白的三个主要成员—MRJP 1~3的定量分析方法系统研究。经对大量经碳同位素比值质谱法和花粉检测并判定为真实性蜂蜜样本的UPLC-TQMS检测,建立了真实蜂蜜中的MRJP 1~3含量数据库,并设置了蜂蜜真实性检测阈值。通过模拟掺假、商品蜂蜜检测,与碳同位素比值质谱法和花粉检测方法比对,验证了本方法在蜂蜜真实性检测中的有效性,为国际上精准检测和判断蜂蜜的真实性,建立新的精准检测标准提供了关键技术和依据。

Results and Discussion

王浆主蛋白MRJPs的定性鉴别

利用超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF)对经胰蛋白酶酶解的蜂王浆主蛋白多肽进行定性检测,以从UniProt数据库中获得的MRJPs的肽序列信息为参照,通过ProteinLynx Global Server(PLGS)软件对获得的数据进行比对分析,成功鉴定出8个王浆主蛋白(MRJP1~7和MRJP 9)的一级序列数据,共有108条多肽,其中24条属于MRJP1,28条属于MRJP2,21条属于MRJP3,14条属于MRJP4,11条属于MRJP5,3条属于MRJP6,6条属于MRJP7,1条属于MRJP9。8种王浆主蛋白(MRJPs)的多肽覆盖率分布于1.7~76.6%(表1)。

1 MRJPs及其酶解多肽的分析结果

蛋白

理论酶解

多肽数

实测多肽数

多肽覆盖率*(%)

转移TQMS

多肽数

稳定的

多肽数

UniProtKB

条目号

MRJP 1

28

24

76.6

15

10

O18330

MRJP 2

35

28

72.0

18

8

O77061

MRJP 3

30

21

55.5

13

7

Q17060

MRJP 4

31

14

37.7

10

2

Q17061

MRJP 5

32

11

22.7

7

4

O97432

MRJP 6

28

3

5.9

1

1

Q6W3E3

MRJP 7

31

6

10.3

4

2

Q6IMJ9

MRJP 9

29

1

1.7

1

0

B3GM12

Total

244

108

/

69

34

/

*多肽覆盖率通过Protein Lynx Global Server Version 2.5 软件估算

蜂蜜中MRJPs候选标志多肽的筛选

基于UPLC-TQMS对蜂蜜中所有王浆蛋白的候选多肽进行重复性检测分析,从108条候选多肽中初筛选出峰面积较高,其中重现性较好的有34条多肽。然后以多肽的易酶解性和酶解后稳定性两个指标作为合适的标志多肽筛选标准,对7种王浆蛋白的34条多肽展开分析。依据两个评判指标,将所有的候选多肽依次分成5类:A.易酶解且稳定;B.易酶解但不稳定;C.不易酶解但稳定;D.不易酶解且不稳定;E.无规律。经过从高到底等级的比较分析,最终成功为筛选出一条属于B类的MRJP 1特异性标志多肽:YNGVPSSLNVISK,属于A类为筛选出一条MRJP 2特异性标志多肽:TLQMIAGMK;属于A类一条MRJP 3特异性标志多肽:LTVAGESFTVK(表2)。

表2 标志多肽及其内标肽的多元反应监测(MRM)

蛋白

多肽

母离子

(m/z)

子离子

(m/z)

锥孔电压 (V)

碰撞能量 (eV)

MRJP 1

YNGVPSSLNVISK

689.4

335.1#

40

30

944.5

40

25

YNGVPSSL*NVISK

692.9

335.1#

40

30

951.5

40

25

MRJP 2

TLQMIAGMK

496.8

215.1#

35

15

778.4

35

15

TL*QMIAGMK

500.3

222.1#

35

15

778.4

35

15

MRJP 3

LTVAGESFTVK

576.3

215.1#

35

20

838.4

35

20

L*TVAGESFTVK

579.8

222.1#

35

20

838.4

35

20

#同位素标记肽

*定量离子,L*= Fmoc-Leu-OH (13C6, 15N)

蜂蜜中MRJP 1~3定量方法的建立与方法学验证

分别合成MRJP 1~3的3条特异性标志多肽标准品及其同位素标记肽,建立了MRJP 1~3定量检测的UPLC-TQMS检测方法。并通过标准曲线、精密度、回收率,定量限分析,对所建方法进行方法学验证,结果显示符合美国临床实验室标准协会CLSI C62-A的相关要求。采用UPLC-TQMS法,对洋槐蜜、油菜蜜、荆条蜜和荔枝蜜等四种常见蜂蜜和玉米糖浆、大米糖浆和高果糖浆等三种常见蜂蜜掺假糖浆进行MRJP 1~3定量分析。结果表明,洋槐蜜、荆条蜜、油菜蜜、荔枝蜜中均含MRJP 1~3等3条特异性标志肽,在玉米糖浆、大米糖浆或高果糖浆等任何一种蜂蜜掺假物中未能检测到,证实MRJP 1~3属于蜂蜜的特异性内源蛋白。对模拟糖浆掺假蜂蜜检测分析结果表明,掺入高果糖浆的浓度与所掺入蜂蜜样品中的MRJP 1~3含量负相关(R2>0.99),证明了采用MRJP 1~3为蜂蜜内源性标志蛋白具有应用于掺假蜂蜜检测的可行性(图1)。

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