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原标题：FSHW:胃蛋白酶水解鲟鱼肌肉提取的多肽部分通过MAPK和NF-κB途径对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞发挥抗炎作用

Highlights

鲟鱼肌肉蛋白产生抗炎肽

鲟鱼肽具有很强的抗炎和抗氧化活性

鲟鱼肽在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中发挥抗炎作用

Introduction

炎症是人体对各种炎症因子的防御反应，是许多疾病中最常见的病理过程。当生物组织受到细菌、病毒、内源性毒物等刺激时，免疫系统所维持的“平衡体”状态被打破，导致炎症信号的级联反应。炎症细胞的聚集被诱导，细胞趋化机制被启动。这些细胞释放出大量的细胞因子，包括白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以及其他炎症介质，如一氧化氮（NO）、前列腺素（PG）等。IL-6是一种多功能细胞因子，在炎症性疾病中升高，还会诱导多种具有抗炎特性的因子表达，包括IL-10、IL-1R拮抗剂等。炎症介质和细胞因子的过度释放会导致器官损伤以及慢性疾病。迄今为止，不受控制的炎症越来越多地被认为是心血管疾病、抑郁症、癌症等的危险因素，在过去的几年里，抑制炎症细胞因子的合成或活性已成为治疗炎症的主流。最常用的治疗药物有类固醇、非类固醇抗炎药、单克隆抗体等，但很多药物都伴随着不良副作用，如降低组织的可修复性、损伤胃肠黏膜等。因此，寻找更安全、更高效的天然抗炎化合物是一个很有前景的策略。

目前，许多研究已经证实，氧化损伤是加速慢性炎症发展的关键。炎症反应的改变以及氧化还原失衡通常发生在许多非传染性疾病（NCDs）中。一些研究表明，抗炎肽通常伴随着强大的抗氧化潜力。

鲟鱼是一种古老且濒危的商业化水产养殖品种，具有很高的经济和生态价值。以往的研究已经报道了源自鲟鱼的生物活性肽的抗氧化和低温保护作用。研究认为，鲟鱼蛋白水解物具有适当的氨基酸含量和良好的理化性质，在食品工业中具有潜在的应用价值。目前，除鲟鱼鱼子酱在全球被广泛食用外，鲟鱼的综合利用率和附加值普遍很低，为了更好地利用鲟鱼的副产品，亟需更多的研究，尤其是鲟鱼肌肉，其具有最佳的膳食蛋白质和必需氨基酸，然而对鲟鱼肌肉肽的生物活性的研究却非常有限。许多研究报告指出，鱼类是抗炎肽的良好来源，而关于鲟鱼肽的抗炎功能及其机制的研究却鲜有报道。因此，江苏大学的Ruichang Gao、Li Yuan等在本研究中旨在确定鲟鱼肌肉肽对LPS诱导的RAW264.7细胞潜在的抗炎作用及其机制。

Results鲟鱼酶水解物的抗炎活性

采用5种蛋白酶（Alcalase、木瓜蛋白酶、Neutrase、胃蛋白酶、胰蛋白酶）对鲟鱼肌肉蛋白进行水解。在最佳条件下，Alcalase水解（AH）、木瓜蛋白酶水解（PaH）、Neutrase水解（NH）、胃蛋白酶水解（PeH）和胰蛋白酶水解（TH）的水解度（DH）值分别为（29.95±0.42）%、（32.58±0.64）%、（33.35±0.22）%、（15.7±0.46）%和（31.14±0.14）%。随后，如图1A所示，当RAW264.7细胞与浓度为0.125、0.25、0.5和1.0 mg/mL的5种酶水解物孵育时，与对照组相比，经所有酶水解物处理的细胞活力明显提高。然而，TH处理浓度为2.0 mg/mL时，细胞活力下降到91%。此外，5种酶水解物在浓度为0.5 mg/mL时表现出最高的细胞活力。因此，在随后的研究中选择0.5 mg/mL作为抗炎活性的浓度。图1B显示，与未刺激组相比，LPS处理的细胞中NO的产生量增加了5.57倍，而在0.5 mg/mL酶水解物预孵化下，NO的产生量明显减少。PeH在这方面表现最好。其次是AH，但NH没有显示出降低NO含量的潜力。

A.细胞活力；B.LPS刺激RAW264.7细胞产生NO。

图1 鲟鱼肌肉酶水解物对细胞活力的影响

抗炎肽的纯化过程

接下来，用超滤和Sephadex G-15凝胶过滤纯化PeH。如图2A，2B所示，用LPS单独处理RAW264.7 24 h，NO和IL-1β的分泌分别显著增加7.76倍和9.22倍。＜3 kDa的肽部分显示出最强的抗炎活性，在0.5 mg/mL时可抑制31.77%的NO和38.72%的IL-1β，因此用Sephadex G-15凝胶过滤色谱法进一步分离＜3 kDa的部分。根据分子量的不同（图3A）观察到3个吸收峰（1、2、3；MW：F1＞F2＞F3）。F2的抗炎活性比其他组分更强（图3B，3C）。与LPS组相比，F2对NO和IL-1β的抑制活性分别为42.61%和50.10%。同样，F2的抗炎效果最好，对IL-6的抑制率为39.04%，对TNF-α的抑制率为47.00%（数据未显示）。同时，与单用LPS组相比，F2的预处理对促炎细胞因子的降低呈剂量依赖性（图4A～4D）。纯化后，F2中Phe、Tyr和Glu的含量分别增加到（19.35±0.07）%、（15.39±0.13）%和（11.84±0.11）%。此外，与PeH（37.49%）相比，F2中的疏水氨基酸含量（57.35%）明显增加。

A. NO的产生；B. IL-1β水平。

图2 PeH超滤组分对LPS刺激的RAW264.7细胞抗炎活性的影响

A. Sephadex G-15分离的＜3 kDa肽部分的色谱图；B. NO的产生；C. IL-1β水平。

图3 从PeH中纯化抗炎肽

A. NO的产生；B. IL-1β水平；C. IL-6水平；D. TNF-α水平。

图4 F2组分对LPS刺激的RAW264.7细胞中促炎细胞因子产生的影响

F2的抗炎机制

众所周知，JAK-STAT、MAPK和NF-κB通路在炎症反应中起着关键作用。单独使用LPS（2 μg/mL）可显著增加ERK1/2、JNK和p38的磷酸化（分别为4.66、5.9、8.0倍）。用F2预处理后，ERK1/2、JNK和p38磷酸化水平分别显著降低25.5%、29.7%和46.29%（P＜0.01）（图5A）。此外，与LPS单独处理相比，用0.5 mg/mL F2预处理可显著抑制细胞质中IκBα的磷酸化和降解（抑制率为37.11%）（P＜0.01）。同时，LPS使细胞核中p65的表达量增加了2.29倍，F2预处理后，这种情况显著减少（图5B）。结果表明，F2的抗炎作用至少部分归因于MAPK信号通路对IκBα磷酸化和p65核转位的抑制和抑制。

A. 蛋白质印迹法测定p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38和p38的水平；B. 蛋白质印迹法分析RAW264.7细胞的胞质和核提取物中NF-κB p65、IκBα的含量。

图5 F2组分对RAW264.7细胞中LPS刺激的MAPKs和NF-κB蛋白的影响

Conclusion

本研究结果表明，鲟鱼肽通过下调LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞的MAPK和NF-κB途径发挥抗炎作用。鲟鱼肌肉水解物作为一种丰富的抗炎食品成分，应用前景广阔。然而，水解物中的特异性活性肽序列仍需进一步探索。同时，有必要进一步研究评估这种抑制特性是否也会影响其他炎症因子和趋化因子的分泌，还需要进一步对鲟鱼肽进行体内研究，以明确目前研究的意义。

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