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原标题：华中农业大学彭大鹏教授：动物组织中基于吉他霉素单克隆抗体的ic-ELISA检测方法及其分子识别机制研究

近日，华中农业大学彭大鹏教授团队制备了KIT特异性抗原并开发了单克隆抗体，建立了动物组织中的ic-ELISA方法和样品制备方法以监测KIT残留。研究成果“Development of a monoclonal-based ic-ELISA for the determination of kitasamycin in animal tissues and simulation studying its molecular recognition mechanism”正式发表于Food Chemistry（IF=6.301）。彭大鹏教授为该论文通讯作者，博士生李龙为该论文第一作者。

Abstract

为了监测吉他霉素（KIT）的残留，建立了基于KIT特异性单克隆抗体KA/2A9的间接竞争酶联免疫吸附方法（ic-ELISA）。Ic-ELISA经过系统优化后，对KIT的IC50为5.7±1.4 μg/ L，在不同动物组织中的LOD范围为22.47 μg/ kg ~ 29.32 μg/ kg，添加回收率为70％ ~ 120％，且变异系数低于20％。接着，首次制备出了命名为KA/2A9/3的KIT特异性单链抗体（scFv）。同源建模和分子对接结果表明，KA /2A9/3 scFv与KIT结合的关键氨基酸是TYR-92（CDRL3），SER-93（CDRL3），ASP-155（CDRH1）和GLY-226（CDRH3），其中氢键是主要作用力。随后，通过虚拟突变提供了一种进化KA/2A9/3 scFv抗体的方法。这些结果有助于理解抗原-抗体结合机制，并为KIT 特异性scFv的体外亲和力成熟提供理论支持。

Introduction

吉他霉素（KIT）是一种含有16元环的大环内酯类抗生素（图S1）(Arsic, Barber, Čikoš, Mladenovic, Stankovic, & Novak, 2018)。由于KIT对支原体，革兰氏阳性细菌，某些革兰氏阴性细菌，钩端螺旋体和立克次体等具有广谱的抑菌活性，其已在畜禽养殖中被广泛用于控制呼吸道和肠道疾病，促进生长和提高免疫力(Leclercq, 2002)。与其他抗生素相似，动物组织中的KIT残留会诱导人体中存在的细菌产生抗药性，最终导致超级细菌的出现(Alban, Nielsen, & Dahl, 2008; Ferri, Ranucci, Romagnoli, & Giaccone, 2017)。考虑到KIT的危害，许多国家在猪和家禽的可食用组织中将最大残留限量设置为200 μg/kg。因此，灵敏而准确的检测方法对于监控动物源性食品中的KIT残留至关重要。迄今为止，仪器方法被认为是检测动物源性食品中KIT残留的最常用方法，例如超高效液相色谱串联质谱（UPLC/MS/MS）(Tang, Lu, Lin, Shin, & Hwang, 2012)和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）(Lan et al., 2019)等。然而，众所周知，仪器方法昂贵且费时，不适用于现场快速检测大量样品。相比之下，间接竞争性酶联免疫吸附测定（ic-ELISA）和金免疫色谱测定（GICA）等免疫测定方法更加便捷，灵敏，硬件要求低，并且适合于筛查大量样品。但是，动物源性食品中KIT残留的免疫分析方法少见报道。Guo及其同事制备了针对KIT的单克隆抗体，在该抗体的基础上，开发了用于检测KIT残留的GICA方法，该方法的IC50为1.51 μg/L(Guo, Liu, Cui, Ma, Wu, & Kuang, 2019)。但是，此GICA方法仅可用于检测鸡蛋和牛奶样品中的KIT残留。目前，尚无关于其他动物产品中的KIT免疫测定的研究。众所周知，抗体是免疫测定的核心试剂。目前，一些大环内酯类抗生素特异性抗体已经被开发出来(Z. Wang, Beier, & Shen, 2017)，例如泰乐菌素(Lai，Lv，Zhang，Xiong，Lai，＆Peng，2020)，替米考星(Le, Zhu, & Yang, 2015)，阿维菌素(Ni et al., 2019; C. Wang, Wang, Jiang, Mi, & Shen, 2012)和伊维菌素(Xie, Kong, Liu, Song, & Kuang, 2017)。出乎意料的是，即使这些大环内酯类抗生素与KIT具有相似的化学结构，这些可以识别其他大环内酯类抗生素的抗体对KIT也不敏感。近年来，随着噬菌体展示技术的广泛应用，仅由重链和轻链可变区组成的单链可变片段（scFvs）已成为开发免疫测定的新兴材料(Hammers & Stanley, 2014)。大量研究表明，scFv抗体的识别能力不低于其亲本单克隆抗体的识别能力(Li, He, Ren, Zhang, Du, & Li, 2016; Lee, Syed A, Leow, Tan, & Leow, 2018)。此外，scFv抗体为探索抗原-抗体相互作用的机理提供了极好的材料，这有助于分析在具有相似结构的两种药物的特异性抗体之间为什么没有交叉反应。抗体亲和力代表抗体与其相应抗原之间的结合强度。ScFv抗体的另一个优势是它们可以通过分子对接技术探索scFv与抗原的结合机制，从而指导scFv的改造并进一步提高抗体的亲和力(Tao et al., 2020; Xu et al., 2009)。在以前的报道中，采用分子对接技术研究了不同的scFv抗体与相应药物的结合机制，比如吩噻嗪(Shi, Zhang, Xia, Liu, Zhang, & Wang, 2017)，阿莫西林(He et al., 2017)，莫能菌素 (Makvandi-Nejad, Sheedy, Veldhuis, Richard, & Hall, 2010)和氟喹诺酮(Leivo, Lamminmäki, Lövgren, & Vehniäinen, 2013)，然后将不同的基因诱变方法应用于scFv进化。结果表明，与其亲本scFv抗体相比，进化后的scFv表现出对各个分析物的亲和力提高。因此，探索scFv抗体与相应抗原之间的相互作用机制对于获得高性能抗体是非常有意义的。在这项研究中，我们制备了KIT特异性抗原并开发了单克隆抗体，建立了动物组织中的ic-ELISA方法和样品制备方法以监测KIT残留。随后，为探索抗体与药物靶标之间的相互作用机制，首次应用噬菌体展示技术筛选出了针对KIT的scFv抗体。最后，对KIT特异性scFv抗体进行了虚拟突变，提供获得更好的KIT特异性scFv的进化方法。

Materials and methods

1. 试剂和材料本研究所用的化学药品均为分析试剂级。用于ELISA的吉他霉素，泰乐菌素，替米考星，螺旋霉素，红霉素，乔沙霉素，阿维菌素和伊维菌素均购自中国兽药检验所。次黄嘌呤/胸腺嘧啶/氨基蝶呤（HAT），次黄嘌呤/胸腺嘧啶（HT），PEG 1450，牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA），羧甲氧基胺半盐酸盐（CMO），二甲基亚砜（DMSO）和弗氏佐剂购自美国Sigma公司。二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）由国药集团化学试剂有限公司提供。DNA聚合酶，DNA限制性核酸内切酶和T4连接酶购自美国NEB公司。 HRP-anti E-tag抗体，HRP-anti M13抗体，噬菌粒pCANTAB5E，大肠杆菌TG1和大肠杆菌HB2151获自美国Amersham Biosciences公司。本文所述的所有溶液和缓冲液均采用标准方法制备。2. 合成抗原KIT-CMO-BSA/OVAKIT-CMO-BSA/OVA偶联物是参考Kolosova等人的方法制备的(Kolosova, Shim, Yang, Eremin, & Chung, 2006)。将总计77.10 mg（100 μmol）的KIT溶解在5 mL甲醇中，将12 mg（110 μmol）的羧甲氧基胺半盐酸盐和8.40 mg NaHCO3（100μmol）溶解在1 mL ddH2O中，然后在搅拌的状态下缓慢加入KIT甲醇溶液中。在室温下孵育2 h并在60 °C旋转蒸发后，将产物溶于5 mL CHCl3中，并除去有机相。将黄色产物溶解在含有12 mg N-羟基琥珀酰亚胺和20 mg N，N-二环己基碳二亚胺的2 mL N，N-二甲基甲酰胺溶液中，在黑暗中搅拌孵育过夜。将BSA（32.5 mg，0.5 μmol）添加到20 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中并在4°C下冷却2 h以制备蛋白质溶液。将过夜混合溶液（2 mL）缓慢滴加到蛋白质溶液中，并在4 °C下保持过夜。随后，以10,000 r/min的速度离心10 min，并将上清液在4 °C的条件下透析3天，每12小时更换一次透析液。以相同的方式制备KIT-CMO-OVA，不同的是用22.5 mg的OVA代替BSA。3. 制备单克隆抗体本研究中描述的所有动物实验均遵守华中农业大学动物实验中心的指导原则，并经动物伦理委员会批准。使用KIT-CMO-BSA作为免疫原，按照标准杂交瘤生产程序来制备KIT特异性单克隆抗体。将50 μg KIT-CMO-BSA溶于无菌H2O（0.25 mL）中，然后用等体积的弗氏完全佐剂乳化，并以三点或四点颈部和背部皮下注射的方式每两周一次注射8周大的雌性Balb/C小鼠。然后，用等体积的弗氏不完全佐剂乳化相同量的免疫原，并以相同的方式给予注射。 8天后，从小鼠的尾静脉收集血清，并通过ic-ELISA测量血清的效价。细胞融合前的72到84 h，对滴度高的小鼠进行了200 μg/ml不含佐剂的免疫原的腹膜内加强注射。将免疫小鼠的总脾细胞悬液与5×107 SP2/0骨髓瘤细胞在0.8 mL 50％ PEG1450中融合。经HAT选择培养后，使用ic-ELISA评估杂交瘤细胞上清液的质量。将有限稀释法用于克隆高度敏感的ELISA阳性杂交瘤细胞，直到上清液中生活的所有杂交瘤细胞均为3倍阳性为止。将克隆的杂交瘤细胞（RPMI-1640中为1.0×106）注射到Balb/C小鼠中，然后小鼠腹膜内注射0.5 mL弗氏不完全佐剂进行处理。十天后，收集腹水并用于ELISA。4. ELISA程序根据前人描述的方法，采用ELISA方阵获得包被抗原和单克隆抗体的最佳浓度(Peng et al., 2016)。将KIT-CMO-OVA在包被缓冲液中稀释至1、2、4、8、16、32、64和128 mg / L的浓度，并在4℃下孵育过夜。将酶标板用PBST洗涤3次，并在37 ℃下用1％ OVA（250 μL/孔）封闭板1小时。再洗涤3次后，加入100 μL/孔的PBS连续稀释抗体（1:10 000 – 1:128,000），并在37 ℃温育1h。然后用PBST洗涤3次，添加100 μL/孔的稀释（1:5000）山羊抗小鼠IgG-HRP，并在37 °C下孵育1h。在最后的洗涤步骤之后，通过添加TMB底物（100 μL/孔）进行比色检测。加入50 μL/孔的2 M H2SO4，温育15 min以终止反应，并在450 nm处读取吸光度。从结果中，我们获得了最佳的ELISA包被抗原浓度和单克隆抗体浓度。使用上述ELISA程序，通过比较KIT和大环内酯类似物的IC50来评估交叉反应率（CR）。将大环内酯类似物（包括吉他霉素，麦迪霉素，交沙霉素，螺旋霉素，乙酰螺旋霉素，红霉素，泰乐菌素，替米考星，阿维菌素，伊维菌素）配制成适当浓度，以测定CR。分析物标准溶液的浓度范围为1至100,000μg/ L，CR的计算公式为CR％=（KIT的IC50 /分析物的IC50）×100％。5 样品制备和ELISA分析组织样品处理方法如下：称取均质猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏样品2.00g于50mL离心管中，加入10 mL 40％（v / v）甲醇的0.3％偏磷酸溶液，涡旋1 min，4000 r/min离心10min。取上清液0.5 mL于10mL离心管中，用4 mL的CHCl3萃取，涡旋混匀1分钟。4000 r/min离心5 min。取下层CHCl3溶液，蒸发并溶于2mL PBS中。样品的稀释倍数为20。组织最低检测限（LOD）测定如下：使用收集的20种不同的空白样品进行ELISA验证。采用上述ELISA方法确定样品的空白基质作用范围并确定LOD。LOD计算方法是20个空白样品的平均值加上3倍标准差。此方法在不同样品上的回收率和变异系数（CV）：将样品添加不同浓度（100、200、400 μg/ kg）的KIT标准溶液，混合并在室温下孵育30 min。按以上方法处理样品并进行ELISA检测。对于每个样品浓度，均测量了5个平行样，并在不同时间点重复了3次。使用以下公式计算回收率：回收率（％）=（测量的浓度/加标浓度）×100。Cut-off值确定：准确称取20份样品，添加最大残留限量200 μg/kg的KIT标准溶液。用建立的ELISA方法确定添加样品中药物的浓度，并计算标准差。 cut-off值是通过从测得的药物浓度中减去1.64倍标准差计算得出的。6. 抗原抗体分子识别机制研究

单链抗体噬菌体文库制备

将收集的KA / 2A9杂交瘤细胞（1×107）在室温以1300 r/min离心10 min。根据使用说明书，使用TRIzol试剂裂解细胞以提取RNA。使用Qiagen mRNA纯化试剂盒纯化mRNA，并使用SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System试剂盒进行RT-PCR，将所有mRNA合成为cDNA。表S1中列出了用于VH和VL基因扩增的引物序列和比例。SfiI和NotI限制性酶切位点包含在VL的5’引物和VH的3’引物中。采用Taq聚合酶扩增VH和VL基因，50 µL反应混合物中含有2 µL cDNA和1 µL VH或VL引物混合物。PCR程序为95 ℃ 2min；94 ℃ 1min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1min循环30 次。将PCR扩增出的VH和VL产物等量混合，然后使用SOE-PCR组装全长scFv基因。使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行样品纯化。用NotI和SfiI核酸内切酶同时酶切扩增的scFv和pCANTAB5E噬菌体载体，并在16℃下用T4连接酶将scFv片段插入噬菌体载体pCANTAB5E。通过电击转化将插入scFv的噬菌粒转化到大肠杆菌TG1细胞中。将电击转化的细胞在SOBAG培养基上培养，并在37 °C下孵育14 h。然后收集菌落，与甘油混合并在-80℃下保存。

KIT特异性噬菌体单链抗体的淘选和可溶性表达

使用M13K07辅助噬菌体，将构建的噬菌体文库用于制备噬菌体抗体。将文库原液在2×YT-AG培养基中培养成对数期，用M13KO7辅助噬菌体营救，并于30 ℃下，2×YT-AK培养基中扩增过夜。用4％ PEG/0.5 M NaCl溶液沉析噬菌体，并溶解在无菌PBS中。在进行生物淘选之前，将噬菌体scFv和MPBS以3：2的比例在室温下孵育30 min，然后将噬菌体scFv添加到包被有1% OVA的免疫管中，并在室温下孵育30 min。免疫管涂有KIT-CMO-OVA（第一轮为40 ppm，其余两轮分别为20 ppm和10 ppm），并用2％ MPBS溶液封闭。将噬菌体抗体缓冲液添加到免疫管中，并在37 °C下孵育1 h。分别使用PBS和PBST将免疫管洗涤20次。结合的噬菌体用0.1 M甘氨酸-盐酸洗脱，然后加入2 M Tris中和。随后，将混合物与10 mL对数期大肠杆菌TG1细胞在37 ℃下以200 r/min摇动孵育50 min。最后将该溶液以不同的稀释率铺在SOBAG板上，并在30 ℃下孵育过夜。挑取单克隆菌于96深孔细胞培养板中培养以筛选特异性抗体。使用KIT-CMO-OVA包被的酶标板筛选噬菌体抗体。该方法与已建立的单克隆抗体ELISA方法相似，并且使用小鼠HRP-anti M13进行筛选。将噬菌体抗体分别添加至含有50 μL PBS和50μL 10 mg/L KIT标准溶液的两个孔中。将阳性噬菌体抗体应用于感染对数期大肠杆菌HB2151细胞，并在SOBAG-N培养基上进行培养。将生长的克隆挑入2×YT-AG培养基中，并在30 ℃ 以250 r/min摇动孵育过夜。随后，将过夜培养物以1:100的比例添加到2×YT-AG培养基中，并在30 °C下以250 r/min的温度孵育1 h。将培养物1500 g离心20 min以除去上清液，然后将沉淀物重悬于50 mL 2×YT-AI培养基中，并在30°C摇动250 r/min孵育8 h。使用重组噬菌体抗体系统的方案制备可溶性scFv抗体。使用ic-ELISA方法确定scFv的滴度和灵敏度。包被抗原浓度为8 mg/L，ic-ELISA方法使用HRP-anti E-tag抗体。使用IMGT数据库分析了单链抗体的FR（框架区）和CDR（互补决定区）。

单链抗体序列分析及三维结构预测

ScFv核苷酸序列由生工生物公司（中国上海）测序。在International ImmunoGeneTics基因技术信息系统数据库（http://imgt.cines.fr/）（Lefranc，2007）中分析了可变区序列及VH，F… VH和VL序列提交至WAM-Web抗体模型数据库（http://antibody.bath.ac.uk/index.html）（Whitelegg＆R… 4.2.6软件进行结构预测。分析了最佳的KIT和scFv抗体结合构象（Sotriffer，Flader，Winger，Rode，Liedl和Varga，2000）。

Results and Discussion

1. 单克隆抗体的制备

据报道，羧甲氧基胺半盐酸盐（CMO）常被用作间隔臂来设计半抗原，并被用于开发红霉素，泰乐菌素和其他小分子药物特异性单克隆抗体(Lai et al., 2020; Z. Wang et al., 2015)。因此，在本研究中，半抗原KIT通过间隔臂CMO与牛血清白蛋白（BSA）结合以合成免疫原。用免疫原KIT-CMO-BSA注射Balb/C小鼠3次后，取小鼠血清进行棋盘滴定和ic-ELISA实验，分别测定血清抗体滴度和亲和力。实验结果表明小鼠血清抗体滴度为1:64,000，IC50为242 μg/ L，达到细胞融合的要求。细胞融合9天后，通过ic-ELISA分析96孔板的培养上清液，筛选出两个高滴度的稳定杂交瘤细胞。在5次亚克隆之后，成功建立了两个最佳的单克隆杂交瘤细胞系，称为KA /1H8和KA/2A9，并获得了单克隆抗体（mAbs）。抗体亚型鉴定结果表明，由KA/1H8和KA/2A9细胞系分泌的抗体亚型均为IgG1同种型。

2. 单克隆抗体的鉴定

选择单克隆杂交瘤细胞系KA/1H8和KA/2A9用于制备小鼠腹水。7~12d后收集腹水检测效价和灵敏度。如表S2所示，包被原的最佳浓度为8 mg/L，从KA/1H8和KA/2A9腹水中提取的单克隆抗体的效价分别为1:640,000和1:8000。单克隆抗体KA/1H8和KA/2A9的IC50值分别为13.9 μg/L和5.7 μg/L。因此，选择了高灵敏度的单克隆抗体 KA/2A9用于ic-ELISA的开发和优化。

3. ic-ELISA的条件优化

图1. 所建立的ELISA方法的标准曲线通过方阵实验测定，包被原的最佳浓度为8 mg/L，KA/2A9单克隆抗体的最佳稀释浓度为1:40,000。根据倍比稀释药物浓度，建立了标准曲线，其回归方程为y = -0.610x + 0.995，R2 = 0.995（图1）。标准曲线的范围为1.25 ~ 20 μg/ L，标准曲线的IC50值为5.7 ± 1.4 μg/ L（n = 5），LOD为1.49 μg/ L，表明所建立ic-ELISA方法的高度敏感（表S3）。KA/2A9 单克隆抗体与大环内酯类抗生素的交叉反应（CR）如表1所示，该抗体可识别麦迪霉素和交沙霉素，但对其他大环内酯类抗生素（如泰乐菌素和替米考星）无识别能力。

4. ic-ELISA方法的验证