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中国科学院上海营养与健康研究所武爱波研究员团队：建立与验证

同时测定发酵茶中四种黄曲霉毒素含量的一步净化法结合液相色谱-串联质谱法

中国科学院上海营养与健康研究所武爱波研究员团队在 Food chemistry 上发表名为《Development and Validation of the One-step Purification Method Coupled to LC-MS/MS for Simultaneous Determination of Four Aflatoxins in Fermented Tea》的研究性文章，本研究旨在通过优化发酵茶前处理过程，建立了一种低成本、操作简单的液相色谱-串联质谱法同时检测发酵茶中四种黄曲霉毒素含量。武爱波研究员为通讯作者。

黄曲霉毒素B₁是发酵茶生产和贮藏过程中最受关注的潜在化学污染物。但目前茶叶基质定量分析方法仍有不足，基于改进的样品预处理方法，建立了一种简便、快速、灵敏、准确、廉价的液相色谱-串联质谱方法（LC-MS/MS），同时检测发酵茶中4种黄曲霉毒素的方法。样品先用乙腈提取，随后通过自制净化管净化后上样。在最佳LC-MS/MS条件下，定量限为0.02 ~ 0.5 mg·kg^-1。黄曲霉毒素加标回收率为78.94 ~ 105.23%，相对标准偏差小于18.20%。该方法已成功地应用于发酵茶样品中黄曲霉毒素的测定。

1、简介

茶叶按生产加工的发酵程度分为绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶、红茶和黑茶，它们具有不同的特征化学物质。茶叶因含有抗氧化、抗菌、抗癌和抗炎物质等特性而备受关注。发酵茶中存在许多微生物，主要包括曲霉属、嗜热酵母菌属和厚壁菌门，这些微生物有利于茶叶特有香气和活性成分的形成。然而，后发酵茶渥堆发酵是一种湿热环境，后发酵茶处在复杂的工业环境中极易受到各种产毒真菌的污染，存在着较高的真菌毒素产生和累积风险。真菌毒素是茶叶种植、生产、储存和消费过程中最常见的潜在化学污染物，不仅影响消费者的健康，而且会造成巨大的商业损失。如今，茶叶的质量和安全越来越受到关注，真菌毒素相关风险评估也不例外。在多种真菌毒素中，黄曲霉毒素因其毒性、致癌性、致畸性和诱变性而引起人们的特别关注。黄曲霉毒素被国际癌症研究机构列为IA类致癌物。许多国家在食品中都建立了严格的限制指标。

近年来，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）广泛用于测定各种食品基质（如水果、蔬菜、谷物及其制品、中草药等）中的黄曲霉毒素。然而，少数研究集中在茶叶样品中黄曲霉毒素的定量和定性测定。消除基质效应是LC-MS/MS定量分析前样品预处理过程中的主要挑战。因此，建立一种能有效减少茶叶基质干扰的真菌毒素检测方法势在必行。目前，不同的净化技术已经应用于茶叶样品预处理过程用于降低基质效应的干扰。例如，串联多个固相萃取柱（SPE）净化，基于QuEChERS提取并利用多功能净化柱（MFC）结合免疫亲和住（IAC）净化。MFC-IAC净化方法通常用于复杂样品基质的预处理过程，但是它复杂且昂贵。因此，一种有效、准确、简便、廉价、减少基质效应的前处理工艺对液相色谱-质谱联用技术测定茶叶中黄曲霉毒素具有重要意义。

随着各种样品前处理方法的发展，样品检测过程逐步优化。目前，基于纳米材料、生物材料和合成材料的样品预处理和分析技术被认为是真菌毒素检测的重要方法。近年来，二氧化硅/氧化石墨烯与多壁碳纳米管已成功应用于谷类作物和食品中黄曲霉毒素的检测。此外，氨基化多壁碳纳米管对茶多酚和叶绿素的去除能力以及基于多壁碳纳米管的黄曲霉毒素检测生物传感器已被报道；但是其在液相色谱-质谱联用法测定发酵茶中黄曲霉毒素的预处理过程中应用较少。

本研究基于羧基化纳米碳管建立了一种一步净化茶叶基质的方法，旨在建立一种简便、高效的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析发酵茶中黄曲霉毒素的方法，实现低检测限、高灵敏度。

2、LC-MS/MS方法优化

茶叶是一种不同于其他食品基质的干燥且松散的基质。因此，提取是茶叶中黄曲霉毒素含量测定的关键步骤。大多数真菌毒素在有机溶剂中高度溶解，包括乙腈、甲醇、丙酮和乙酸乙酯。已有报道称乙酸乙酯由于具有良好的脂溶性，可以提取大量的叶绿素；因此，乙酸乙酯不再被选择作为备选萃取剂。与甲醇相比，乙腈具有更高的提取效率，对比了不同萃取剂的基质匹配曲线，可以看出茶叶基质共萃取物对目标化合物的电离信号有很强的抑制作用，而与其他溶剂相比，乙腈对基质的抑制作用最弱。有趣的是，可以看到乙腈共提物颜色比甲醇共提物浅。与过去的研究不同，同时考虑基质效应和回收率的情况，最终选择乙腈作为萃取溶剂。为了改进净化方法，在我们的初步实验中评价了不同单一填料的净化以及黄曲霉毒素回收效果。结果表明，8种填料（PSA、SG、AL-N、AL-A、NH2、HLB、D101和AL-1）的净化回收率较好。在LC-MS/MS法测定黄曲霉毒素时，虽然一些用于消除基质效应的填料已被文献描述报道；但由于使用同位素内标来补偿基质效应去除缺陷，茶叶基质的净化成本仍然很高。我们也发现了单一填料SG或HLB的净化回收率较好，但净化后样品并不适合质谱分析。同时在我们的预实验中，发现了6种填料（MWCNTS- COOH、MWCNTS- NH2、MWCNTS- OH、MWCNTS、GO和GCB）具有良好的色素去除能力。此外，有研究表明MWCNTS- COOH、MWCNTS- NH2、MWCNTS- OH、MWCNTS和GCB对茶多酚、叶绿素和叶黄素具有很好的去除能力。最后，我们选择对黄曲霉毒素回收率最好的羧基化多壁碳纳米管作为吸附剂进行下一步研究。最终优化三种净化填料的配比后，其具有最好的净化和回收率效果。我们比较了混合填料和各种多功能净化柱对黄曲霉毒素回收率，表明我们的自制的净化管具有取代商业多功能净化柱的潜力。

为了优化质谱参数，我们采用全扫描方式对黄曲霉毒素进行监测，m/z范围为0 ~ 500，以获得合适的前体离子。根据不同的前驱离子，用不同的氩气碰撞诱导解离（CID）得到产物离子谱，最后利用碰撞能量产生合适的产物离子，根据各黄曲霉毒素的产物离子丰度，选择m/z值为285.200 （AFB₁）、259.300 （AFB₂）、200.100（AFG₁）、189.100（AFG₂）的产物离子作为定量离子。黄曲霉毒素是一种小分子且中等极性的芳香族分子（log Kow = 0.5-1.45），在之前的LC-MS/MS分析中，它仅因C₁₈链的疏水性而被保留。为了选择色谱柱，我们以峰面积和信噪比（S/N）为考核指标；发现与传统C18柱相比，YMC-Triant PFP色谱柱（含有氢键、偶极和п-п作用）可以提高芳香族化合物的保留，具有更高的灵敏度。最终黄曲霉毒素的测定采用Accela 1250 UPLC系统与TSQ Vantage TM三重四极杆质谱联用仪，采用YMC-Triant PFP色谱柱，流动相A（5 mm乙酸铵水溶液），流动相B（乙腈）梯度洗脱，流速0.35 mL·min^-1，进样体积为10 μL。采用反应监测（SRM），在正电离模式（ESI⁺ 3.5 kV）下进行质谱分析。

3、方法验证及应用

根据欧盟文件（SANTE/126823/2019）的指导原则，在优化的条件下验证了开发的LC-MS/MS方法的分析参数。采用新开发的LC-MS/MS方法对20份后发酵茶样进行了检测。AFB₁含量为0.09 ~ 0.67 µg·kg^-1, 20份阳性样品中有3份含有AFG₁，平均浓度为0.10 µg·kg^-1；生茶和熟茶中检测的AFB₂和AFG₂含量均低于定量限。在生茶与熟茶中并没有检测到黄曲霉毒素，或一些阳性样本的黄曲霉毒素都低于限定标准，这与其他学者研究结果相似。总之，市售的20份黑茶样本相对安全，而且生茶中黄曲霉毒素的含量较熟茶低。我们还发现熟普洱茶中黄曲霉毒素的含量因发酵阶段不同而具有差异，最初加湿的渥堆发酵茶样和起堆样中AFB₁含量高于其他样本，但仍低于限量标准。此外，AFB₁含量从第一次翻堆样到第五次翻堆样逐渐下降，这可能是由于发酵生产过程中茶叶样品的环境差异（如温度、湿度、含氧量）所造成。

I ^a_{: Incidence}

N D^b_{: not detectable}

_{n: number of positive samples}

_{N: number of total samples}

4. 结论

首次建立了一步净化法结合LC-MS/MS分析发酵茶中黄曲霉毒素的新方法。该方法是在改进QuEChERS样品制备的基础上，通过优化提取工艺，采用自制净化管（MWCNTs-COOH、HLB、SG）对茶叶共提取物进行净化。根据欧盟指南，该方法已在含有4种不同添加水平的黄曲霉毒素的茶叶基质上成功验证，并应用于市售的20份普洱茶分析。茶叶中未检出黄曲霉毒素，或黄曲霉毒素阳性样品的浓度低于规定的相关限量标准。与传统的样品前处理方法相比，本方法在保证回收率和定量限的前提下，具有低成本、操作简单等优点，进一步提高了方法的易用性和通用性。该方法的建立为复杂基质中大量痕量真菌毒素或其它化学物质的特异性分析提供了一种有针对性的方法。

该研究得到了国家重点研发计划项目（2018YFC1604403）经费支持。

通讯作者简介：

武爱波，博士，中国科学院上海营养与健康研究所研究员、博士生导师，食品安全与真菌毒素研究组组长，长期从事食品中真菌毒素检测、安全性评价与污染控制研究。现任国家食品安全风险评估专家委员会委员、全国微生物学会微生物毒素专业委员会委员、中国预防医学会食品卫生分会委员、《Food Control》、《Toxins》编委。曾在荷兰瓦赫宁根大学、比利时根特大学与法鲁汶大学合作研究。近5年，在Springer出版英文学术专著《Food Safety & Mycotoxins》（2019，十章全部为通讯作者），以通讯/共同通讯作者在Anal Chem、Food Control、Food Chemistry等期刊上发表研究论文28篇，他引次数1500余次。主持国家/地方科研项目10多项，成果成功实现转化与大范围应用至政府、大型企业食品安全监管，获中国食品科学与技术学会杰出青年奖（2017）、全国分析测试协会科技进步奖一等奖（2016，第2）。

第一作者简介：

周海燕，2014年9月至2018年6月年就读于甘肃农业大学食品科学与工程学院食品科学与工程专业；2018年9月进入中国科学院上海营养与健康研究所，食品安全与真菌毒素研究组攻读硕士研究生；2020级中国科学院上海营养与健康研究所在读博士研究生；研究方向：食品安全。

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