Introduction

核桃（Juglans regia L.）是脂质和多不饱和脂肪酸（PUFAs）的良好来源，亚洲、北美洲、欧洲和南美洲是世界核桃的四大产区。我国是核桃重要的起源地之一，也是世界上核桃的主要生产国之一。我国核桃产区分布较广，可分为西北、东部沿海、华中和西南四个主要栽培区域。随着核桃产业的快速发展，我国近年来核桃产量已跃居世界第一，并培育出丰富和优质的种质资源。新疆是我国最主要的产区之一，2016年核桃总产量达到了69.28万t，位居全国第二，仅次于云南。南疆阿克苏、和田和喀什地区是新疆的三大主要栽培区，其中南疆地区核桃产业已成为当地的支柱产业，核桃收入几乎占到农民收入的一半。近年来，随着机械化程度的提高和育种技术的改良，新疆核桃单位产量不断增加，成为继枣之后特色林果产业的第二大树种。但我国与世界先进国家仍存在很大差距，例如，美国的核桃产量和种植面积虽然远低于我国，但由于具有最高的生产水平和良种化程度，核桃市场份额和出口量的占有率均在50%左右。

作为重要的食用坚果之一，核桃富含蛋白质、氨基酸、脂肪、碳水化合物以及各种微量元素和矿物质等。成熟核桃仁含油脂量61%～74%，蛋白质15%～19%，总碳水化合物8%～13%，水分3%～4%。脂肪酸是核桃仁的主要营养成分，其中不饱和脂肪酸含量占90%，其中包含人体必需的两种脂肪酸，即亚油酸和α-亚麻酸，两者的比例在4:1～6:1之间，被认为可有效预防心血管疾病。由于具有丰富的营养价值和生物活性成分，核桃对人体有健脑益智、降血脂、降血糖、抗氧化和抗癌等诸多功能，因而被广泛用于营养功能食品。

对核桃油的研究，先前大多数主要研究集中在不同核桃品种中油脂和脂肪酸组成的比较及不同发育阶段的变化规律，然而对其油脂积累的分子机制鲜有报道。新疆拥有得天独厚的气候和地形条件，是世界上最适合种植核桃的地区之一。随着核桃基因组数据的发布，已经发现了参与核桃油脂代谢的相关基因。然而，在以往相关研究中核桃甘油三脂（TAG）组装的关键基因，以及与核桃脂质合成相关的转录调控因子仍未得到鉴定。此外，对不同品种的油脂含量和脂肪酸组成，涉及的关键基因及表达模式可能存在的差异也缺乏研究。

浙江大学食品科学与营养系沈立荣教授团队和塔里木大学园林学院吴翠云教授团队对三种新疆特色核桃和它们的不同发育时期进行了转录组学、油脂和脂肪酸比较分析，对核桃油脂积累，特别是多不饱和脂肪酸（PUFA）合成的潜在分子机制、不同品种油脂合成途径中涉及的关键基因进行了挖掘，为新疆特色核桃的分子育种，提高核桃油脂含量，改善PUFA组成提供了理论依据。本文第一作者为浙江大学食品科学与营养系硕士研究生王文强。

Graphical abstract

不同品种核桃油脂积累期的油脂含量及其脂肪酸组成分析

测定了“纸皮核桃（ZP）”、“新乌417（W417）”、“新温81（W81）”3个核桃品种在不同发育阶段的油脂含量及其脂肪酸组成。结果表明，3个品种核桃油脂含量均呈现“慢-快-慢”的变化规律，成熟核桃的含油量接近70%（图1），不饱和脂肪酸比例达到了90%以上。核桃油脂含棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸和二十碳烯酸等6种脂肪酸，其中亚油酸和油酸含量最高，分别呈下降和上升的同步变化趋势（图2），推测亚油酸和油酸在核桃发育过程中存在一定的相互转化关系。根据油脂含量及脂肪酸组成变化规律，本研究确定花后84 d（T1）、98 d（T2）和119 d（T3）这3个发育时期适用于转录组学分析。

（A）3个核桃品种84、98和119 DAF核桃胚发育时期形态特征；（B）3个核桃品种胚发育过程中总含油量的动态变化。

图1 3个核桃品种（ZP、W417和W81）的剖面和总含油量

图2 3个核桃品种（ZP、W417和W81）胚胎发育过程中的脂肪酸组成变化趋势

三个核桃品种不同发育期的转录组测序、组装和基因功能注释

对来源于3个发育阶段的3个核桃品种的27个核桃样品进行转录组测序，在W417、W81和ZP的测序中，分别获得了总数为67.66 Gb、72.21 Gb和70.64 Gb Rawbases，除去衔接子序列，低质量的碱基和不确定的碱基后，产生了超过97%的测序总数据量（Cleanbases）。将所有34 112个表达基因注释到NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO和KEGG 6个公共数据库，共有30 320（88.88%）个表达基因在6个数据库中获得了注释，其中COG和NR数据库中注释的基因数目最多，分别为30 312（88.86%）和29 862（87.54%）。而GO和KEGG数据库的注释率最低，分别注释了15 279（44.79%）和12 992（38.09%）个基因（表1）。

表1 Unigene功能注释结果

核桃样本间的PCA分析和差异基因表达分析

为了了解基因表达在核发育过程中的动态变化，采用27个样本的每百万转录本（TPM）数据进行差异表达基因（Different expressing genes，DEGs）分析（图3A）。分析了来自不同发育阶段和品种的3个两两比较组。W417、W81和ZP三个发育阶段的对照组（T1 vs T2、T2 vs T3和T1 vs T3）分别包含1 800、1 145和1 352个DEGs，共得到3 375个非冗余DEGs（图3B）。ZP与W417、ZP与W81、W417与W81在3个阶段分别存在12 094、8 133和7 402个非冗余DEGs。这样，三种比较中包含的2 578个差异共表达DEGs（图3C）。共鉴定出5 040个非冗余的DEGs冗余基因，从不同时期和品种中分别发现913个DEGs（图3D）。

（A）27个核桃样品的主成分分析；（B）W417、W81和ZP不同阶段间的DEGS交点数；（C）3个发育阶段W417、W81和ZP之间的DEGs结合数；（D）B的并集与C的交集的DEGs的总和。

图3 3个核桃品种差异基因（DEGs）的主成分分析及维恩图

差异表达基因的聚类分析

为了更好地了解各组间差异基因的表达模式，进行了聚类分析。以TPM值为基础，对不同时期、不同品种共表达的5 040个DEGs进行了聚类分析。结果表明，3个品种的T1和T2期聚类良好，亚簇IV和亚簇V中的基因可能在脂质生物合成和核发育中发挥关键作用（图4）。

（A）差异表达基因的层次聚类分析，颜色条表示差异表达基因标准化为lg TPM后的表达水平，红色代表高表达，蓝色意味着低表达；（B）5个亚组差异表达基因的表达模式。

图4 差异表达基因的聚类分析

差异表达基因的GO功能注释和KEGG富集分析

为了确定这些差异表达基因的具体功能，进行了GO功能注释分析。鉴定得到的不同品种和不同发育时期样品间的差异表达基因（分别为3 375和2 578个）注释到GO数据库中，获得注释的分别有1 348个基因（Group Ⅰ）和1 795个基因（Group Ⅱ）。这两组基因均分为三个主要功能类别，包括生物学过程（biological process，BP），细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF），并进一步划分为36个含有10个基因以上的亚类。其中BP类被划分为13个子类别，CC类别被分为12个子类别，MF类被映射为11个GO术语。这些基因的注释结果表明，不同品种核桃在生长和发育过程中发生了强烈的代谢活动（图5）。

图5 不同品种差异表达基因（Group Ⅰ）和不同发育时期差异表达基因（Group Ⅱ）的GO功能分类

各发育阶段之间的差异为3 375个DEGs，通过KEGG富集分析，对品种间2 578个DEGs进行分析，探讨这些DEGs参与的代谢途径（图6）。

（A）Group Ⅲ中差异表达基因的KEGG富集分析图；（B）Group Ⅳ中差异表达基因的KEGG富集分析图。

图6 差异表达基因的KEGG富集分析

油脂合成相关基因的鉴定

挖掘参与油脂生物合成的差异表达基因对探讨核桃油脂积累的分子机制至关重要。因此构建了通过示意图和热图可视化的脂质生物合成途径，以显示三个核桃品种在胚胎发育过程中基因表达水平的动态变化，其中64个基因用于脂肪酸（FA）从头合成，45个基因用于三酰甘油组装，17个基因用于脂质生物合成油体，有19个基因编码的10种关键酶（ACCase、LACS6、LACS8、SAD、FAD2、FAD3、LPAAT1、DGAT2、PDAT2和PLC）与脂质生物合成高度相关，其中SAD、FAD2和FAD3在核桃仁中高度表达，这可能是核桃富含不饱和脂肪酸的主要原因。随后通过对27份核桃样品的表达水平进行相关性分析，鉴定了WRI1、ABI3、FUS3、PKL和VAL1等5个与油脂合成相关的转录调控因子，这些转录因子主要的调控基因包括ACCase、KASⅡ、LACS、FAD3和LPAAT（图7）。

热图的颜色代表基因在不同样品之间差异倍数的对数，红色代表上调，蓝色代表下调。

图7 核桃中脂肪合成途径中的差异表达基因

为了进一步研究所鉴定转录因子与参与脂质生物合成的基因在转录水平上的相关性，对采用Person算法计算出的相关系数用热图可视化（图8）。

热图的颜色代表相关性系数的大小，红色代表正相关，蓝色代表负相关。青绿色代表基因间相关性系数的绝对值小于0.5，q＞0.05。

图8 转录因子和脂质油脂合成相关基因表达水平之间的相关性分析

最后通过qRT-PCR验证了ZP中9个关键基因的表达（W417和W81分别验证了5个基因），证明定量结果与转录组测序数据之间有很强的相关性（R²＝0.90889，P＝1.62×10^-32）。这些研究结果将为核桃遗传工程和分子育种提供全面的认识和有价值的信息。

本研究对三种新疆特色核桃，即“纸皮核桃（ZP）”、“新乌417（W417）”、“新温81（W81）”和它们不同的发育期开展了转录组学、油脂和脂肪酸比较分析。脂质分析结果显示，成熟核桃仁含油量接近70%，其中90%以上的脂肪酸为PUFAs。转录组学分析确定了126个候选基因，其中64个基因用于脂肪酸从头合成，45个基因用于三酰甘油组装，17个基因用于脂质生物合成油体；19个编码的ACCase、LACS6、LACS8、SAD、FAD2、FAD3、LPAAT1、DGAT2、PDAT2、PLC等10个关键酶与脂质生物合成高度相关的基因；通过对27份核桃样品基因表达水平相关性分析，鉴定出WRI1、ABI3、FUS3、PKL和VAL1等5个与油脂合成相关的转录调控因子，并确定其主要调控基因可能包含ACCase、KASII、LACS、FAD3和LPAAT。 这些发现将为核桃遗传工程和分子育种提供全面的认识和有价值的信息。

第一作者简介

王文强，浙江大学生工食品学院毕业硕士研究生，主要研究方向为食品营养与安全。