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原标题：内蒙古农业大学张和平教授研究团队：应用种群基因组学和全基因组关联分析探讨德氏乳杆菌保加利亚亚种的工业潜力
游牧民族制作和食用天然发酵乳制品（naturally fermented dairy products，NFDP）已有数千年历史。通常，NFDP富含乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）。其中一种典型的LAB：德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus）只存在于特定的地区。它是一种主要的酸奶发酵剂，由于具有较高的经济价值而受到广泛关注。德氏乳杆菌保加利亚亚种在牛奶酸化中起着重要作用，有助于保存和发展奶制品风味、质地和维生素。但该菌种的遗传背景、进化史和功能特征，在基因组水平上尚不清楚。
关于德氏乳杆菌保加利亚亚种的遗传和基因组多样性的研究数据并不充分，因为该菌种的早期研究只集中在少数菌株上。Tanigawa和Watanabe（2011）利用多位点测序分型技术，对41株德氏乳杆菌进行了多样性分析，发现该菌株具有较高的遗传多样性。内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室的张和平教授研究团队从NFDP中分离得到德氏乳杆菌保加利亚亚种，分析发现其祖先菌株的系统进化与蒙古分离株最接近。也就是说，德氏乳杆菌保加利亚亚种是从蒙古扩散到俄罗斯和中国新疆。Liu等人（2012）比较了4 种来自德国的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的基因组（ATCC 11842、BAA-365、BAA-2038和ND02），发现ND02菌株的基因组中编码蛋白酶、肽、酶和氨基酸转运系统的基因数量明显增加，这可能是导致其独特的发酵特性的原因。然而，由于缺乏公开的数据，有关德氏乳杆菌保加利亚亚种的种群结构和遗传特征的信息是有限的。此外，Makarova等（2006）分析了9 种LAB的基因组，发现在富营养环境中，与合成途径相关的一些酶丢失或突变，这些遗传变化最终导致形成了一些营养缺乏的菌株。在德氏乳杆菌保加利亚亚种中也观察到了这种现象，但尚未进行深入分析。
近年来，LAB基因组测序取得了长足进展，在撰写本文之时，NCBI数据库中已有50 个完整的德氏乳杆菌基因组和草图基因组，包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳杆菌、delbrueckii、jakobsenii、indicus和sunkii。其中，只有19个德氏乳杆菌保加利亚亚种的基因组是可用的，因此不能进行大规模的群体遗传分析和GWAS分析。深入的基因组分析将有助于识别判定该菌种发酵特性的基因组特征。
目前的研究对从广泛区域和各种发酵食品中收集的NFDP中分离出的188株德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株进行了高覆盖率全基因组测序（补充表S1，https：//figshare.com/s/4471858b0681af3ea270）。然后，通过整合从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索到的德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组序… 个与地理起源相关的类群，同时观察到糖利用酶的进化显著减少。本研究为了解德氏乳杆菌保加利亚亚种的遗传多样性提供了新的认识。
RESULTS
基因组组装与变异检测
188 株分离株的基因组大小和GC含量分别为1.76±0.03 Mb和（49.9±0.2）%（补充图S1，https://figshare.com/s/20af160b4d03df584185）。我们的基因组组装结果与NCBI数据库中的记录一致（补充表S2，https://figshare.com/s/4471858b0681af3ea270）。 以ATCC11842型菌株为参考，共鉴定出45149 个SNP，其中22381 个为同义的，13839 个为非同义的，8929 个为基因间。大多数的SNP为罕见SNP（次要等位基因频率<5%），而普通SNP（次要等位基因频率>5%）仅占总SNP的28.9%。每个菌株的平均突变数为5357。有趣的是，几乎三分之一（43/131）的抽样乳制品中含有1 种以上的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，这表明在同一NFDP样本中存在多个德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。平均而言，从同一样本分离的菌株之间的SNP距离为1778（补充图S2，https://figshare.com/s/20af160b4d03df584185），表明德氏乳… 份含有多个菌株的样本中有18 份（42%）属于不同的亚群。从同一样本分离的菌株之间存在显著差异，这表明即使在同一自然发酵的乳制品样本中，德氏乳杆菌保加利亚亚种的生物多样性也很高。
不同类群菌株的基因组差异
基于207 株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株基因组（包括从NCBI检索到的19 个基因组），发现了一个包含6448 个基因的开放全基因组和一个包含759 个基因的稳定核心基因组（图1C）。基于核心基因组比对（图1A）和45149 个 SNP的串联序列（补充图S2A，https://figshare.com/s/20af160b4d03df584185）构建了系统进… 个亚种型菌株（乳酸亚种DSM20072、indicus亚种DSM15996、delbrueckii 亚种JCM1012、jackobsenii 亚种ZN7a9和sunkii亚种 JCM17838）被列为外群（补充图S2B，https://figshare.com/s/20af160b4d03df584185），支持Hie… 个类群的种群结构。观察到4 个类群，即H1到H4（图1A）。
Figure 1. Geographical distribution and phylogeny of 207 strains of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.
207 株德氏乳杆菌保加利亚亚种的地理分布和系统进化
不同类群菌株表型差异及GWAS分析
通过随机选择和分析25 个分离株（每个类群5～9 个分离株）的表型来确定4 个德氏乳杆菌保加利亚亚种类群的发酵特性。使用糖代谢试剂盒检测德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株对碳源的利用能力，并在不同时间点记录每个菌株的底物消耗情况。然后，对不同谱系分离株的糖代谢能力进行比较分析（补充表S3，https://figshare.com/s/4471858b0681af3ea270）。结果表明，… 种碳源，不同谱系的菌株在底物利用能力上存在较大差异。H4谱系表现出中等水平的底物利用能力。H1谱系可消耗的糖底物类型最少，而H2和H3谱系可利用的糖底物明显多于其他组（图2D）。
Figure 2. Functional gene differences among different genetic clusters of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.
图2 德氏乳杆菌保加利亚亚种不同基因类群的功能基因差异。
DISCUSSION
我们前期的研究表明，基于多种核DNA标记，从NFDP分离出的德氏乳杆菌保加利亚亚种具有广泛的遗传多样性。目前的研究结果巩固了我们以前在基因组水平上的发现。结果表明，中国西藏的H1类群是德氏乳杆菌保加利亚亚种的主要遗传多样性来源。同时，我们还在单个样本中检测到了多株具有明显遗传差异的德氏乳杆菌保加利亚亚种分离株，这表明德氏乳杆菌保加利亚亚种在每个样品中均以复杂多样的形式存在。我们的研究小组先前在中国和蒙古的一些自然发酵产品中发现，德氏乳杆菌保加利亚亚种是优势菌。在以后的研究中，有必要在未来的研究中进一步探索NFDP中的德氏乳杆菌保加利亚亚种的群落演替。
尽管由于无性系种群结构和细菌同源重组导致的假阳性率较高，GWAS在细菌基因组分析中应用较少，但它已成功用于分析来自不同宿主的192 株弯曲杆菌分离株，从而证实了一个与牛相关的重要区域的菌株与维生素B5生物合成表型之间的联系，从而促进了弯曲杆菌在牛体内的定殖。据我们所知，这项研究是为数不多的利用GWAS来识别LAB基因型与表型之间关联的研究之一。在Ldb2036基因上鉴定出1 个SNP位点，该位点与德氏乳杆菌保加利亚亚种分离株的发酵特性有显著的相关性。Ldb2036变异与CT升高有显著相关。不过，我们未能通过异源表达乳酸脱氢酶蛋白及其变体，无法在体外验证其活性（数据未显示）。进一步的尝试将有助于了解SNP的功能作用。通过对多个分离株的蔗糖强化重组脱脂乳发酵特性（CT、FT、APR）的进一步验证，利用Ldb2036基因中所鉴定出的SNP位点其预测准确率达到80%。以上结果表明，GWAS定义的SNP基因型可作为预测和快速筛选工业菌株产酸能力和公共数据库中可用基因组序列的进一步筛选的方法。环境生态似乎是促使NFDP德氏乳杆菌保加利亚亚种种群多样化的主要驱动力，并且在发酵环境和遗传适应性之间发现了显著性关联，形成了明显的遗传进化谱系。本研究成功地建立了一个大型基因组数据库，以重建德氏乳杆菌保加利亚亚种分离株的系统发育和种群结构，但未能明确这些分离株的系统发育起源和地理分布途径。然而，GWAS方法可以识别重要表型相关SNP，为筛选具有所需特性的工业菌株提供了一种新的靶点识别方法。
该文章《Exploring the industrial potential of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus by population genomics and genome-wide association study analysis》于2021年3月2日在线发表于Journal of Dairy Science。
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翻译：袁艺；编辑：袁月；责编：张睿梅
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